N/P ratio

유전자를 Carrier에 실어서 보낼 경우 DNA 1ug당 얼마나 보내야 되는지 알아야 할 때 사용함.

N=amine(cation) /P=phosphate(DNA)

1ug DNA= 3nmol phosphate 함유 / 1ug PEI= 10nmol amine 함유

계산 예시)

Luciferase 정량평가 실험

Luciferase 5 ul (200 ug/ml->5 ul를 취해야 1ug/5ul 됨)

DNA 4 ul       (0.25 ug/ul->4 ul를 취해야 1ug/4ul 됨)

Transfection

1.    Complexation DNA+ Carrier : a

2.    30분 RT incubation (PdXYP같은 경우 빛을 피해야 함)

3.    Cell media 제거

4.    PBS로 세척

5.    Change media- *FBS가 없는 media 사용!!

6.    Treatment

   6 well의 경우 2 ml 당 200 ul 넣어 줌(100 ul 넣어줘도 됨)

   24 well 기준으로 500 ul 배지에 50 ul 넣어 줌-벽에 넣지 말고 방울방울 떨어트려 넣어 줌

7.    3시간 incubation

8.    Change media (*FBS가 함유된 media 사용)

9.    48-72시간 정도 transfection 함

10.   Check transfection - ICC, WESTERN, WST 등등으로 확인함)

luciferase assay-(하기 전에 미리 transfection 해 놓기)

준비단계

1.    transfection

2.    48hr(~72hr 까지도 가능) incubation

3.    Remove media(PBS 세척은 안해도 됨)

4.    Add 1x lysis buffer 300 ul (35파이 컬쳐 디쉬 기준)

   - lysis buffer는 5x짜리 희석해서 사용(희석은 3차 증류수로)

5.    Culture dish에 처리한 상태로 -70도에 보관, overnight 이 원칙이나 급할 땐 4시간 정도 처리 가능

6.    -70도에서 꺼낸 후 녹을 때 까지 조금 시간 둔 후에 세포를 EP TUBE에 모아서(voltexing 가능)

7.    Centrifuge 13000 RPM 4도, 20분

8.    상층액만 따서 분리함

9.    Luciferase expression using microreader

Sample reading

1.    Black 96 well plate에 20 ul씩 넣어서 가져가기      

2.    기계 On

프로그램: Wallac 1420 manage 사용순서

   ① 신호등같이 생긴 아이콘 클릭->define plate map

   ②  Luminesence7

   ③  소민 535/40

   ④  샘플 넣은 플레이트 표시 해주기(클릭) 

   ⑤  Luciferase substrate 100 ul 넣어 줌

   ⑥  Tool

   ⑦  Results of assay

   ⑧  Excel file 보임

   ⑨  File->export mc

Analysis of luciferase protein expression

   1. 96 well plate 준비

   2. 10 ul씩 각 well에 넣어 주기

   3. 10 ul 20mM Iodoacetamide도 같이 섞어 주기- to stop lysis activity

   4. Mix well by shaking plate

   5. Incubation 15min at RT

   6. BCA solution (100 ul사용) 섞어 주기

   7. Incubation 15min at RT

   8. ELISA at 570nm